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【発明の詳細な説明】【技術分野】【0001】本発明は、高付加価値リン脂質の製造方法に関し、より具体的には、3体の不飽和脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸（DHA）を構成脂質として含むリン脂質の製造方法に関する。 3つの不飽和脂肪酸. 【背景技術】【0002】血中脂質低下や脳機能、視機能改善などの生理作用を有する機能性脂質として、エイコサペンタエン酸（EPA）やドコサヘキサエン酸（DHA）などの3不飽和脂肪酸が知られている. ヒトに必須のEPAおよびDHA栄養素の両方は、摂取した食品から十分に供給されない可能性がある. 必要な食物摂取を確実にするために、EPAおよびDHAまたは栄養補助食品を含む健康食品材料が広く入手可能である. 2004年には、EPAとDHA成分を含む健康食品が厚生労働省の特定保健用食品として認可されたことから、EPAやDHAなど3種類の不飽和脂肪酸の市場が拡大し、商業用. 一方、脂質を構成脂質とするリン脂質は、脂肪酸自体ではなく、ホスファチジルセリン（PS）による脳機能の改善効果（ノンホスファチジルコリン（PC）による動脈硬化や神経機能障害の改善効果. 最近、PSおよびPCだけでなく、ホスファチジルエタノールアミン（PE）を含有するほとんどのリン脂質が、健康管理栄養補助食品に使用されるために多くの学術的注目を受けている. このような状況下、3脂質を構成脂質とするリン脂質、例えばDHAを構成脂質とするPCまたはPE（以下、それぞれDHA-PCまたはDHA-PEと称する）の抗腫瘍性および抗酸化性などの生理機能DHAリン脂質と呼ばれるDHAを構成脂質とするリン脂質）は、培養細胞を使用する場合だけでなく、動物の生体を使用する場合. DHA-PC、特に2分子のDHA（DHA / DHA-PC）分子を含むPCの分子種において、癌化した動物細胞（マウス白血病細胞）に対する選択的細胞傷害性がDHA-PCに見出されている（非特許文献2）. したがって、3脂質不飽和脂肪酸、特にDHAを構成脂質とするリン脂質の需要が今後増大することが予想される. 構成脂質として3不飽和脂肪酸を含む主要なリン脂質であるDHAリン脂質が供給され、. 主にイカ（特にネオン飛来イカの皮）、その魚油を供給して産卵した魚の卵または卵（特許文献1）.

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ネオンフライングイカはリン脂質を多く含み、その50％がホスファチジルコリン（PC）であり、その構成脂質はDHA（50％）であり、DHAリン脂質の高い割合を脂質に示す. しかし、DHAリン脂質の工業生産は、ネオン飛行イカや魚油などの海産物がDHAリン脂質の供給源と定義されており、変動する漁獲による不安定なDHAリン脂質供給、気候変動、海洋汚染による安全でない製品の安全性. さらなる問題は、魚油に特有の不快な魚臭および魚油に含まれる構造類似性の長鎖高不飽和脂肪酸の精製コストの増加による製品品質および価値の低下である. 上記魚油及び鶏卵由来の卵以外の3不飽和脂肪酸源は、3不飽和脂肪酸を生産する微生物、特にDHAを生産する微生物である. 微生物を用いたDHAの製造方法は、米国で実用化されており、DHA含有脂質や高DHA含有飼料の原料が市場に提供されている. 具体的には、スラウストキトリウム属またはシゾキトリウム属を増殖させる技術（特許文献2）や、トラウストチトリアレス属から抽出した3不飽和脂肪酸を用いる技術（特許文献3）が開発されている. 現在、日本では、ラビリンチュラン微生物をDHA源とする種々の技術が開発されており、具体的には、ラビリンチュラ属の微生物としてS3-2株（特許文献4〜6）、シゾキトリウム属の微生物としてSR21株それを使用する技術（特許文献7〜9）. しかしながら、上記微生物を用いて製造されたDHAはすべて、脂肪（トリグリセリド）の構成脂質としてのDHAであり、リン脂質の構成脂質でも構成DHAリン脂質でもない. 本発明者らは、非光合成単細胞微生物である新規ラビリンチュラ属微生物株12Bを単離し、そのDHAリン脂質生産能を見出し、特許出願した（特許文献10）. この発見にもかかわらず、微生物は総脂質の脂肪酸の40％を超えるDHAを蓄積することができるが、DHAリン脂質含量は微生物の総脂質のわずか12〜13％である. 生物学的材料から調製されるほとんどのDHAリン脂質は、リン脂質分子中にDHAの1分子のみを含む. 実際、構成脂質としてのDHA含量が50％を超える生体物質由来のリン脂質はごくわずかしか報告されていない. したがって、リン脂質中のDHA含量の改善は、機能性食品に加えて医薬用途の価値を高めるために重要な課題である. 【発明の開示】【発明が解決しようとする課題】【0007】本発明の課題は、3つの不飽和脂肪酸を含むDHAリン脂質の製造方法を提供することであり、特に、魚油または鶏卵の卵を原料として使用することなく、簡便な方法で微生物を利用した構成脂質であるDHA. 【課題を解決するための手段】本発明者らは、ラビリンチュアラン12Bのような3不飽和脂肪酸を産生する微生物を、通常の培地で培養することにより、DHAリン脂質含量およびDHAリン脂質量を増加させることができることを見出した炭素源を含有する培養培地中で増殖させた微生物を培養し、以下の発明を完成する. （1）3脂質を構成脂質とするリン脂質の製造方法であって、 炭素源を含有する培地中で3つの不飽和脂肪酸を生産することができる微生物を増殖させる工程;前記培養された微生物を、炭素源を含まない培地.

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（2）3不飽和脂肪酸を生成する微生物が、ラビリンチュア属微生物またはトラウスキドイド微生物である、（1）に記載のリン脂質の製造方法。. （3）ラビリンチュラ類微生物が、ラビリンチュラ類12B株である、（2）に記載のリン脂質の製造方法。. （4）ラビリンチュラ属微生物、スラウストキトリウム属およびシゾキトリウム属に属する群より選択される、（2）に記載のリン脂質の製造方法。. （5）ラビリンチュラ属微生物が、ラビリンスラ属のS3-2株またはシゾキトリウム属のSR21株である、（4）に記載のリン脂質の製造方法。. （6）3不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である（1）〜（5）のいずれかに記載のリン脂質の製造方法。. （7）増殖した微生物を強制通気下で炭素源を含まない培地で培養する、（1）〜（6）のいずれかに記載のリン脂質の製造方法。. 本発明によれば、3不飽和脂肪酸を構成脂質とする高付加価値リン脂質を、3不飽和脂肪酸を大量に生産する微生物を用いて製造することができる. 【発明を実施するための最良の形態】【0015】以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。 図1は、F培地およびZ1培地で培養されたラビリンチュラ株12B細胞の総脂質の一次元TLCのクロマトグラムを示す. （レーン1：30℃で培養72時間後のF培地中の総脂質（250g）、レーン2：30℃で培養した24時間後のZ1培地中の総脂質（250g）、レーン3：全脂質g）は、30℃で培養してから48時間後のZ1培地中で培養した。図2aは、F培地およびZ1培地（プリムリンをスプレーした後、UV照射下で撮影）で培養したラビリンチュラナー12B細胞の総脂質の2次元TLCのクロマトグラムを示す。. （上のパネル：30℃で培養して72時間後のF培地中の全脂質（1mg）、下側パネル：30℃で培養した48時間後の全脂質（1mg））。図2bは、図2aに示すクロマトグラムを概略的に示す. （上部パネル：30℃で培養72時間後のF培地中の総脂質、下側パネル：30℃で培養した48時間後のZ1培地中の全脂質）.

魚油 脂肪酸 割合 推移 北海道 問題

本発明における不飽和脂肪酸は、リノレン酸、オクタデカテトラエン酸、エイコサテトラエン酸、EPAまたはDHAであってもよいが、好ましくはEPAまたはDHAであり、より好ましくはDHA. 3不飽和脂肪酸を産生する微生物としては、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）、デスマレシア・アキュレアタ（Desmarestia acculeata）などのデスマレシア属、クリプテコディニウム・コニー（Crypthecodinium cohnii）、ラビリンスルファン（labyrinthulean）微生物などの渦鞭毛藻類などが挙げられる。. ラビリンチュラ類は、ラビリンチュラ属S3-2（受託番号：FERM BP-7090）などのラビリンチュラ属、ラビリンチュロイデス属、コラロキトリウム属、アプラノキトリウム属、アルバ属属、ジャポノキトリウム属、ウルケニア属、受託番号FERM BP-5034を付与されたシゾキトリウム属（Schizochytrium）菌株SR21のようなスラウストキトリウム属（Schmidtis）およびシゾキトリウム（Schizochytrium）属. また、本発明者らが単離し、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託機関（NPMD、所在地：2）に寄託された、ラビリンチュアラン微生物としてのラビリンチュラン12B株であってもよい2005年1月24日、東京都渋谷区西原5-49-10西日本）の受託番号NITE P-68. 本発明のリン脂質の製造方法における特に好ましい微生物は、ラビリンチュラ株12B. リン脂質の製造方法は、炭素源を含む培地中で3不飽和脂肪酸を生成する微生物を培養する工程. この方法では、使用された3つの不飽和脂肪酸を生産する微生物が細胞の数を増やし、トリグリセリドを蓄積することができる糖および他の炭素源を含む培地を用いて、特定の条件下で、通常条件下で微生物を培養する、脂肪酸、リン脂質および微生物細胞体内の他の脂質. 従って、温度、培地組成、培養液pH、酸素濃度、光度、振とう速度、培養時間など、好適に増殖する微生物の培養条件に応じて、培養に適した炭素源を含む培地それに応じて微生物を選択することができる. スラウストキトリアセイ（Thraustochytaceaceae）微生物の海水培地（酵母エキス - ペプトン - グルコース、水1Lあたり10g、10g、80g、500mL）、海水塩培地抽出物 - ペプトン - グルコース、水1Lあたり2g、9gおよび25g）、渦鞭毛藻類. 上記培養工程において、培地が固体である場合、培養液に添加する水分量の下限は45％（v / w）以上が好ましく、水分量の上限は60％（v / w）以下、より好ましくは45~50％. 微生物細胞体内にトリグリセリド、脂肪酸、リン脂質および他の脂肪を蓄積させるために培養時間が経過するにつれて、使用される微生物の細胞が増加する場合、炭素源の容量で十分であり得る. 本発明のリン脂質の製造方法は、上記の方法で増殖させた微生物を、炭素源を含まない培地. この方法は、以下の前提に限定されるものではなく、炭素源を含む培地中の微生物菌体内に3不飽和脂肪酸を含むトリグリセリドを豊富に蓄積した3不飽和脂肪酸を生産する微生物を好適に栽培することにより、微生物細胞体に蓄積したトリグリセリドを3脂質を構成脂質とするリン脂質に生物変換させることにより、3脂質不飽和脂肪酸を構成するリン脂質を構成脂質として増加させることができる3つの不飽和脂肪酸を構成脂質として含むリン脂質量. 本発明における「炭素源を有さない培地」とは、米糠、小麦ふすま、酢酸、エタノール等の炭素源を含まない培地、特にグルコース、デンプン等の糖類を意味し、微生物細胞体に蓄積したトリグリセリドよりも本発明の微生物.

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また、本発明における「炭素源を有さない培地」とは、微生物菌体内に蓄積した脂肪を用いて微生物を増殖させることができ、3不飽和脂肪酸を含むリン脂質を生産することができる微量の炭素源を含む培地例えば「炭素源を含む培地」で培養した微生物を採取してそのまま使用する場合に予め培養した炭素源を含む培地や、ペプトンに部分的に存在する少量の炭素源を含む培地および培地からなる他の組成物. また、本発明における「炭素源を有さない培地」とは、微生物が生育するのに必要な、または好ましい栄養素を含む培地であることが好ましい. このような培地、培養条件およびその例は、前記「炭素源を含む培地」と同じでもよいし、「炭素源を含む培地」を用いて微生物を培養することにより、微生物菌体に脂肪を蓄積させる培養条件. 炭素源以外の培地からなる他の成分および組成物は、好ましい成長のために使用される微生物. 本発明の特に好ましい態様は、微生物としてラビリンチュラ類12B株を用いてDHAリン脂質を製造する方法である. 炭素源としてグルコースを30℃で含む培地でラビリンチュラ株12Bを培養すると、細胞内に約15g / Lの脂質（脂肪酸として）が蓄積する. このように、ラビリンチュラ株12Bは、微生物を炭素源を含まない培地中で生育させる場合に炭素源として有用な脂肪（トリグリセリド; TG）を豊富に含有する点で有利である. また、ラビリンチュラナン12Bは、炭素源を含む培地で培養し、DHAを用いてDHAリン脂質に変換したラビリンチュラナン12Bに蓄積した脂肪酸の40％以上がDHAであることから好ましい微生物である. ラビリンチュラ株12Bは、組成が比較的単純な培地、例えば、海水50％、ペプトン1％、酵母エキス1％、グルコース8％を含む培地（以下、「培地」という。いわゆるF培地）および生産コストの削減. ラビリンチュラナン12B株を用いてDHAリン脂質を製造する方法においては、上記F培地を「炭素源を含む培地. 「炭素源のない培地」としては、上記F培養液からグルコースを除いた培地や、米ぬかなどの炭素源として有用な他の成分（以下、Z1培地という）を使用することはできない好ましい例として使用する.

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ラビリンチュラナン12Bを用いてDHAリン脂質を製造する方法は、ラビリンチュラン12B細胞を適量のF培地に接種し、30℃で24〜72時間振とう培養し、ラビリンチュラ株12B. その後、培養液の一部または遠心分離により採取した細胞を培養液から適量のZ1培地に加え、さらに30℃で24〜72時間培養することを例示することができる. この方法は、ラビリンチュラン菌株12Bの細胞に、F培地の培養が完了した場合よりも多くのDHAリン脂質を含むことができる. 本発明におけるDHAリン脂質の製造方法は、上記の工程で得られた3不飽和脂肪酸を含むリン脂質を微生物細胞体から構成脂質として抽出または回収し、必要に応じてリン脂質を精製する工程. また、本発明により製造された3不飽和脂肪酸を構成脂質とするリン脂質は、食品、食品添加物、飼料添加物、医薬品などに直接使用することができる。. 本発明は、実施例に限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の範囲内で実施例を変更、修正、修正することができる. By 培養培地（0℃）を含有する寒天平板培地に保存されたラビリンチュラ株12B細胞1白金ループ（約1mg）. 0％寒天）を10mLのF培地（50％海水、1％ペプトン、1％酵母エキスおよび8％グルコース）に接種し、30℃で72時間培養した. 培養液4mLをZ1培地（F培地からグルコースを除去した培地）25mLに植菌し、30℃で48時間培養した. 培養中、培養液のOD600を経時的に測定し、培養後の乾燥細胞重量、乾燥細胞から抽出した総脂質の重量、総脂質中のTG量、リン量、リンから算出したリン脂質重量の割合総脂質の体積を計算し、全脂質からの脂肪酸中のDHA含量を計算した（表1参照）. 一方、ラビリンチュラ株12B細胞の白金耳1本を10mLのZ1培地に直接接種し、30℃で72時間培養した. したがって、Z1培地を用いた直接培養のラビリンチュラン12B株の生育特性は著しく低いと考えられている.

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一方、F培地で72時間培養した培地4mLに含まれるラビリンチュラナン12B細胞の乾燥重量（相当値）は90. ラビリンチュラナン12B細胞を48時間接種したZ1培地で微生物を培養して得られたラビリンチュラ株12B細胞の乾燥重量（相当値）は、235mgであり、2. 0mgは約43％減少し、総脂質中のTG（脂肪酸の量として）は66から有意な減少を示した. これらの結果から、炭素源を含まないZ1培地、特にTGで培養したラビリンチュラン12B細胞に蓄積した内在性脂質は、ラビリンチュラン12B株の生育に消費されたことが示唆された. 一方、Z1培地で培養して48時間後のラビリンチュラナン12B細胞の総脂質中のリン脂質含量（リン含量に相当する値）は、5倍から3倍に増加した. F培地で培養した細胞では7％、Z1培地で培養した細胞では培養後約57％48時間で培養時間が増加し、ラビリンチュラン12B細胞の構成脂質であるリン脂質を含むDHA含量が増加した. 実施例1と同様に、2％ペプトンと2％酵母エキスを含むZ2培地25mlにラビリンチュラナン12B細胞を培養したF培地の培養液4mLを接種し、4％ペプトンと4％酵母エキスを加え、30℃で48時間培養した. 培養後の濁度、採取した細胞の乾燥重量、乾燥細胞から抽出した全脂質の重量、総脂質中のリン量、リン量から算出したリン脂質重量、それらの割合およびDHA含量を決定した（表1参照）. リン脂質は、標準調製物としてホスファチジルセリン（Sigma）を用いて無機リンの体積を測定することによって定量した. その結果、ペプトンおよび酵母エキスの含量を増加させることにより、ラビリンチュラン菌12B細胞の収量が上昇する（Z1培地で23mg、Z2培地で243mgおよびZ4培地で339mg）. Z2培地およびZ4培地で培養したラビリンチュラン株12Bの全細胞脂質中のリン脂質含量は14. また、全脂質中のTG含量は、Z培地中のペプトンおよび酵母抽出物の濃度が増加するにつれて増加した. Z培地中のペプトンおよび酵母エキスの濃度の増加は、全脂質に対するリン脂質の割合を低下させ、増殖した細胞の体積の増加が、産生されたリン脂質の量を増加させることができることが確認された. Z1培地（以下、Z1p、Z1ps、Z1paと呼ぶ）に1mM K2PO4,1mM K2PO4 1mMセリン、1mM K2PO4 1mMエタノールアミンを添加した培養液を調製した. 実施例1と同様に培養することにより、培養後の濁度、採取した細胞の乾燥細胞重量、乾燥細胞から抽出した全脂質の重量、全脂質中のリン量、リン量から算出したリン脂質重量、DHA含量を求めた.

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この結果から、無機リンとアミノ酸を各培地に添加することにより、産生されるリン脂質の量を増加させることができることが確認された. ラビリンチュラ株12BMediumFZ1Z1Z1Z2Z4Z1Z1Z1Glucose aa ------- K2HPO4 ------ エタノールアミン - - セリン------の細胞増殖、リン脂質含量およびDHA含量に及ぼす培地組成および培養時間の影響 - 培養時間（時間）72824484848484848培養液の濁度（600nm）培養開始/培養終了0. 6培養細胞重量の測定培養終了後のZ培地（mg / 29mL）140249235243339205172233細胞変性（mg / mL）22. 4NDNDNDa： ; - を含有する。含まれていない b：白金ループを用いて回収した細胞を10mLのF培地に懸濁した場合のOD600値. c：一部の細胞が凝集して正しいOD600値を得ることができず、おおよその値が示される. 1）By 培地の寒天平板上に保存したラビリンチュラナン12B株の白金耳1本を500mLフラスコ中の200mLのF培地に接種し、30℃で3日間培養した. JFヘッドスペース（1000mL /分）に通気し、30℃で24時間、300rpmの攪拌速度で培養した. 培養条件下では、消泡剤を使用せずに培養液の発泡による損失を低減することができる. 培養液30mLを採取し、乾燥菌体重量、総脂質重量、総リン脂質重量を測定することにより、全培養液あたりのデータを取得した. この値は対照の約2倍であった（フラスコ培養：225μg/ mL / 24時間）. 9mg / mLであり、1時間あたりのリン脂質重量は642g / mL / 24時間であった.

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3）JFヘッドスペースに加えて培養液中の通気（110mL /分）を除いて上記1）の条件で培養した. 7mg / mLとなり、リン脂質生成速度は755g / mL / 24時間（対照フラスコ培養液の約3倍）に増加した. JFControlCulture 1）培養2）培養3）細胞濃度（mg / mL）8. 5全リン脂質（pg / mL培養液/ 24時間）225565642755DHA /全脂肪酸56524549上記の実施例に関する各分析は以下のように行った. 1）全脂質の抽出クロロホルムメタノールを用いた常法（非特許文献11）により乾燥菌体から抽出した脂質を全脂質. 全脂質から極性脂質を分離するために、全脂質サンプル100gをシリカゲルプレート（MERCK、シリカゲルG60）を用いて一次元薄層クロマトグラフィー（TLC）にかけ、. 展開溶媒の組成はヘキサン - エーテル - 酢酸（50：50：1、容量％）であり、. 現像後、プリムリンをプレートにスプレーしてUV照射下のスポットの位置を確認した. クロロホルム、アセトン、メタノール、酢酸および水（50：1：1）の混合物を用いて、クロロホルム、メタノールおよび水（65：25：4、体積比A： 20：10：10：1、体積比で、溶媒B）を2回目の現像に用い、極性ラジカル特有の試薬を噴霧した. 被験物質のスポットを掻き取り、リン脂質をクロロホルム/メタノール混合液で抽出した. リン脂質は、TLCプレート上の検出試薬に対する反応性および3種類の展開溶媒A、BおよびCを用いた1次元TLCによるRfの比較によって同定した. クロロホルム、メタノール、アンモニア水（体積比50:20:10）からなる溶媒C）. 30℃で72時間培養し、30℃で48時間培養した後、ラビリンチュラン株12Bから抽出した全脂質の一次元TLCの結果を図1に示す.

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表2は、TG、遊離脂肪酸、極性脂質および他の中性脂質の脂肪酸量に基づく割合を示す. F培地およびZ培地で培養したラビリンチュラン株12Bの脂質組成およびDHA含量総脂質含量、DHA比、％FZ 1Z 2Z 4TG88. 9）a：全脂質を1次元薄層クロマトグラフィーで分離し、それぞれの脂質クラス量を相対的な脂肪酸容量. b：検出されない c：薄層クロマトグラフィーによって原点から移動しなかった脂質を極性脂質と定義する. ラビリンチュラン微生物株12B細胞をF培地からZ培地に移すと、TGが低下し、遊離脂肪酸と極性脂質の割合が増加する. Z2培地およびZ4培地での培養は、Z1培地での培養と同様にTGの低下および極性脂質の増加を示したが、Z1培地と同様に有意ではなかった. 極性脂質のDHA含有量は、Z2培地で培養された細胞のものを除いて、TG DHA含量を超えた. 図2aは、蛍光物質（プリムリン）をプレート上に吹き付けた後の紫外線照射下で撮影した写真であり、図2bは、図2a. 脂質1,2,3,4,6,7,8および9はDittmer試薬に対して陽性であり、全てリン脂質を示す. 脂質2はホスファチジルイノシトール（PI）、脂質3と4はホスファチジルコリン（PC1とPC2）、脂質6と7はホスファチジルエタノールアミン（PE1とPE2）として同定された。. PCとPEの両方によって提供される2つのスポットのために、構成脂肪酸（特に、DHA含量）が異なることが示唆されている. 0は原点を示し、スポット5および無数スポットはDittmer試薬に対して陰性である脂質である. 3）リン脂質組成及びDHA含有量Z1培地で30℃、48時間培養した後、ラビリンチュラン12B細胞から抽出した全脂質を2次元TLCに供し、Z1培地に由来する脂質の全てを掻き取り、リンIstokovicsらの方法. さらに、生成物を公知の量のヘンエイコサン酸（200g）を内部標準物質として常法に従ってメタノリシスし、脂肪酸メチルエステルをGC. 従って、DHAは、特にPC2において、PCにおいて構成脂質であることが見出された. 6％）のTGが得られたが、これはTLCまたはGCのプロセスにおける多価不飽和脂肪酸の分解に起因する.

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リン脂質組成、48時間Z1培地で培養したラビリンチュラナン12BのDHA含量および収量全脂質への割合（％）全リン脂質に対する割合（％）各脂質クラス（％）DHA含量（％）収率（mg / total培養液（29mL））全リン脂質67. b：2次元薄層クロマトグラフィーにより、PCはPC1とPC2の2つのサブクラスに不完全に分離され、PEはPE1とPE2の2つのサブクラスに不完全に分離される. c：PCおよびPEサブクラスをおおよそ区別することにより、脂肪酸はサブクラスに従って分析される. 比率PC1とPC2、PE1とPE2の量は脂肪酸の量に基づいて計算し、 d：PIにおいて、リンの定量および脂肪酸分析の両方を、単一の脂質クラスとして実施した. e：DHA含量（％）に基づいてDHA含量を計算した.PC1およびPC2、およびIn PE1およびPE2.